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ELISA試劑盒免疫組織化實驗代測染實驗計劃

點擊次數(shù):930 更新時間:2019-01-18
 

1.實驗計劃
ELISA試劑盒根據(jù)課題的內容選用動物,選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體,與其他種屬間無 交叉,則不能用其他 動物,而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠,若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠,否則不能連接成復合物。
② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異,在貼片方面貼于同一張載片上,否則無可比性。
③ 選用的試劑可靠,貨源充足,隨時可取。
2.Ab稀釋度 (如系購買的藥盒有工作液和原液)
(1)工作液:無須稀釋
(2)原液:
① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。
如:工作液濃度為1∶1000, 可選1∶500,1∶1000,1∶1500試驗;
若: 1∶500有背景,1∶1000陽性反應稍淺,可選1∶750進行試驗。
② 原液的保存(—20℃)凍存——應選稀度凍存。
③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍,而后分裝10μl/瓶→凍存(-20 ℃)于 冰箱備用。
④ 關于Ab保存應參照說明書。
(3)Ab濃度的選擇
Ab濃度不可太高或太低,因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行,若一方過剩則形成復合物小且少;極 過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性。——并非Ab濃度越高越好。
3.Ab滴片技術
—— 所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。
[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干,但不能干片。
要領:甩凈組織周圍的水。
4.PBS洗滌技術
(1)洗滌的目的
① 保證離子濃度和PH值。
② 減少非特異反應(平時Ab不可靠很純)
(2)方法:洗三次,每次5分鐘。
5.Ab孵育技術
(1)必須在濕盒內進行,以防抗體的蒸發(fā)和干片。
(2)溫度與時間 4℃:過夜;
37℃:2 h or 參考說明書
6.光鏡控制顯色方法
(1)室內操作:注意溫度與時間的關系,室溫zui宜5分鐘。
(2)染色稍淺亦可拿出,脫水,封片后顏色可加深。
對照組和染色結果的評價
從以下幾 個方面綜合評價:
1.陽性染色特點
① Ag定位,胞漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。(非特異性~細胞與組織無區(qū)別)
② 染色強度不同:顏色深淺不一(非特異性染色 彌散性均勻)
2.組織切片制作過程的影響
① 固定不良—非特異性染色,顯示不均。
② 邊緣干燥—非特異性染色(常見),加抗體時勿干片。
3.ELISA試劑盒人工假象與特異性結果顯示不在同一平面上。
陽性對照:
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色。對照切片呈陽性結果,標為陽性對照。
陰性對照:
用確證不含已知抗原的標本作對照,應呈陰性結果,稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種,陰性對照 還應包括空白、替代、吸收和抑制實驗。
▲ 染色失敗的幾種原因:
(1)所染的全部切片均為陰性結果,包括陽性 對照在內。全部(-)原因可能:
① 染色未*嚴格按照操作步驟進行;
② 漏加一種抗體,或抗體失效;
③  底物中所加H2O2 量少或失效;
¥ 復染或脫水劑使用不當
(2)所有切片均呈陽性反應,原因可能是:
① 切片在染色過程中抗體過濃,或干燥了。
② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確,洗滌不*。
③ 使用已變色的呈色底物溶液,或呈色反應時間過長。
④ 抗體溫育的時間過長。
⑤ H2O2 濃度過高,呈色速度過快。粘附劑太厚。
(3)所有切片背景過深,原因可能是:
① 未加酶消化處理切片。
② 切片或涂片過厚。
③ 漂洗不夠。
④ 底物呈色反應過久。
⑤ 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。
(4)ELISA試劑盒陽性對照染色良好,檢測的陽性標本呈陰性反應。
zui常見的原因是:標本的固定和處理不當。

 

 
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