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斑點氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用步驟

點擊次數(shù):809 更新時間:2020-05-21
 
  斑點氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用步驟:
 
  一、樣品 DNA 的制備
 
  1. 用自選方法純化樣品的 DNA,本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
 
  2. 如果有 N 個樣品,則需要進行 N+2 個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作:
 
  3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液(足夠 10 個樣品)為例:在一干凈塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一,20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水,充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置,但*在一周內(nèi)用完,不要長期放置。一次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液,1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字,配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。
 
  4. 在標記好的 N+2 個離心管中,加入 1-5mg 固體樣品(半粒芝麻大小)或 5uL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照,在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。
 
  5. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液,確保固體樣品被溶液淹埋,如果是液體樣品則震蕩混勻。
 
  6. 95℃保溫 10 分鐘。
 
  7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。
 
  二、弓形桿菌屬通用PCR試劑盒 設(shè)置 PCR 反應(yīng)(40 uL 體系)
 
  8. 在 N+2 個 PCR 管中加入下列成分,下面以樣品數(shù)為 1 舉例(注意:如果*次使用DNA 釋放劑,*每個樣品設(shè)置兩個模板用量的 PCR 反應(yīng),兩個反應(yīng)的模板使用量差 10 倍,由此確定*用量,以后就用效果*的那個模板用量):
 
9. 輕柔混勻后上機,按下面參數(shù)進行 PCR。
 
  10. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。預期的 PCR 產(chǎn)物長度為 216bp。陽性對照必須有此條帶出
 
  現(xiàn),陰性對照必須無任何擴增,否則實驗無效。對沒有擴增產(chǎn)物的樣品,需要用通用引物(如真核生物專一 PCR 引物,需自備)測試是否有抑制劑或樣品是否濃度達到 PCR 的要求,如果通用引物也擴不出來,需要濃縮并再次純化 DNA 樣品,或者更換 DNA 提取方法,直到通用引物能夠擴增出預計大小的片段。
 
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